生命科学学院季雄团队揭示RNA聚合酶亚基RPB7偶联磷酸酶CTDP1稳定Pol II并介导转录再起始
RNA聚合酶II（Pol II）是真核生物细胞核中负责合成mRNA的核心机器。Pol II的C端结构域（C-terminal domain, CTD）在转录的过程中经历动态的磷酸化修饰：未磷酸化的Pol II通过磷酸化进入转录起始阶段，随后进一步磷酸化进入延伸阶段，并在转录终止时达到最高磷酸化水平。然而，高磷酸化的Pol II如何转变为未磷酸化状态，并重新进入转录再起始的分子机制仍不清楚。此外，Pol II的磷酸化修饰与RNA加工事件紧密偶联，但在转录终止后再起始的过程中，Pol II的去磷酸化如何与RNA加工协同完成的机制也尚未阐明。
论文截图
近日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心季雄团队在Nature Communications发表了一篇题为“CTDP1 and RPB7 stabilize Pol II and permit reinitiation”的研究论文，该研究深入探讨了Pol II在转录终止后重新起始过程中的调控机制。研究结果显示，Pol II亚基RPB7与磷酸酶CTDP1相互作用，促进Pol II去磷酸化，并维持Pol II蛋白稳定，进而协助转录终止后的重新起始。值得注意的是，RPB7在RNA聚合酶复合物中定位于RNA输出通道口，这一特殊定位使其能够与多种RNA结合蛋白发生特异性相互作用，从而参与RNA加工过程的调控。这种独特的空间构象和功能定位为转录终止与共转录RNA加工的协同完成提供了结构基础。
季雄团队此前利用蛋白质瞬时降解联合多种功能基因组研究技术，系统研究了Pol II的12个亚基的异质性1，并揭示了亚基RPB3通过CBC-PCF11通路特异性调控核糖体蛋白基因的3'末端加工过程2，表明亚基存在特异性的基因表达调控功能。在此基础上，本研究进一步聚焦Pol II茎部结构域的独特亚基RPB7，以探究其在哺乳动物细胞中的功能特性。
研究人员结合非标记定量质谱（Label-free MS）分析以及蛋白质免疫印迹（Western blot）实验，发现RPB7的缺失会导致Pol II大亚基（RPB1）蛋白水平显著下降。此外，环区缺失的RPB7突变体也无法稳定RPB1，而当使用CDK9激酶抑制剂抑制RPB1的磷酸化水平后，低磷酸化状态的RPB1得以稳定。为了进一步解析这一机制，研究人员借助TurboID邻近标记技术对RPB1的邻近蛋白质组进行定量分析，结果显示RPB7缺失后，磷酸酶CTDP1与RPB1互作水平显著下降。而CTDP1的缺失同样会导致RPB1蛋白水平降低。此外，研究人员还发现，当同时删除RPB1羧基端的Linker和CTD区域后，RPB1的稳定性不再受RPB7和CTDP1调控。
此外，研究人员还发现E3泛素连接酶CUL3的敲除能够挽救RPB7或者CTDP1缺失所导致的高磷酸化RPB1降解。细胞组分分离实验表明，高磷酸化RPB1无法结合染色质，这意味着RPB7和CTDP1在稳定RPB1的同时，促进其重新结合到染色质上。为进一步验证两者在Pol II转录再起始中的作用，研究人员利用转录暂停释放实验（DRB release-Pol II ChIP-seq）发现，RPB7或者CTDP1的缺失均会导致Pol II在转录起始位点的再起始效率下降。此外，RPB7的缺失还会导致低磷酸化Pol II在转录起始位点的结合能力下降，而CTDP1的缺失则无此影响。
进一步的互作蛋白质组数据分析表明，相较于Pol II其他亚基，RPB7与多种RNA加工因子具有更强的相互作用，并且能够影响这些因子与Pol II的互作。通过对RPB7缺失前后的RNA-seq数据进一步深入分析，鉴定出117个转录通读事件。CTDP1缺失同样引发了类似现象。此外，RPB7和CTDP1的缺失还会影响RNA剪接过程，导致外显子比例下降。这些结果一致表明RPB7与新生RNA加工过程密切相关。
综上所述，本研究鉴定到Pol II亚基RPB7的关键互作蛋白——磷酸酶CTDP1，并揭示了RPB7与CTDP1协同调控Pol II蛋白稳定性及其转录再起始过程的分子机制。这一调控过程受到激酶CDK9、E3泛素连接酶Cullin 3、RPB7的环区、RPB1的CTD及其Linker区域的调控。此外，RPB7紧邻Pol II复合物的RNA出口通道，并与RNA加工因子相互作用，参与RNA加工过程的精细调控。这些发现不仅加深了对Pol II在转录终止后如何重新启动新一轮转录过程的理解，也为共转录RNA加工调控研究提供了新的思路。值得注意的是，CTDP1已被证实与多种疾病有关，包括先天性白内障、面部畸形、神经病变综合征3。因此，该研究揭示的CTDP1在转录循环中的关键调控功能，将为探索相关疾病的发病机制提供重要线索。
图1. CTDP1和RPB7协同调节Pol II转录循环中的蛋白稳定性及RNA加工。Pol II在转录终止时，需要进行去磷酸化。RPB7可以招募CTDP1对Pol II进行去磷酸化，并进一步促进低磷酸化Pol II在基因启动子处重新启动新一轮转录。一旦RPB7或CTDP1的功能受损，共转录RNA加工过程将出现缺陷，高磷酸化Pol II会在核质中积累，最终被E3泛素连接酶CUL3的蛋白降解途径所清除，该过程依赖CDK9、CTD以及Linker区域
季雄为该论文的通讯作者，生命科学学院博士生郑浩楠和许杞钦为该论文的共同第一作者。北京大学生命科学学院博士生季德洵和已毕业本科生杨博钦为该工作提供了重要帮助。该工作得到国家自然科学基金原创探索项目、北大-清华生命科学联合中心、核糖核酸北京研究中心（BEACON）、启东创新基金、成都研究院前沿创新基金、基因功能研究与操控全国重点实验室、细胞增殖与分化教育部重点实验室和科技部国家重点研发计划的资助，以及北京大学凤凰工程多个仪器平台的大力支持。
参考文献：
1. Li, Y. et al. Targeted protein degradation reveals RNA Pol II heterogeneity and functional diversity. Molecular cell 82, 3943—3959 e3911, doi:10.1016/j.molcel.2022.08.023 (2022).
2. Li, Y. et al. RNA Pol II preferentially regulates ribosomal protein expression by trapping disassociated subunits. Mol Cell 83, 1280—1297 e1211, doi:10.1016/j.molcel.2023.02.028 (2023).
3. Varon, R. et al. Partial deficiency of the C-terminal-domain phosphatase of RNA polymerase II is associated with congenital cataracts facial dysmorphism neuropathy syndrome. Nature genetics 35, 185—189, doi:10.1038/ng1243 (2003).
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