生命学院王宏伟课题组与合作者揭示果蝇内源小干扰RNA加工的结构基础
清华新闻网2月27日电 RNA干扰（RNAi）作为一种高度保守的RNA沉默机制，在基因表达调控、病毒感染防御以及基因组免受转座子活性影响等方面发挥着关键作用。与miRNA（micro-RNA）和exo-siRNA（exogenoussmall interfering RNA）介导的小RNA干扰过程相比，目前关于较长且具有复杂结构的endo-siRNA（endogenoussmall interfering RNA,esiRNA）的加工、成熟及其功能机制的研究相对有限。
2月20日，清华大学生命学院王宏伟课题组与复旦大学麻锦彪课题组合作，在《核酸研究》（Nucleic Aids Research）杂志上发表了题为“果蝇Dicer-2和Loqs-PD加工产生内源siRNA的结构基础”（Structural basis of endo-siRNA processing by Drosophila Dicer-2 and Loqs-PD）的研究论文。该论文通过冷冻电镜单颗粒技术结合体外生化实验，阐明了果蝇Dicer-2（Dcr-2）剪切产生成熟esiRNA的过程及其结构机制，并揭示了Loqs-PD在该过程中发挥的必要作用。
Dcr-2/Loqs-PD复合物加工pre-esiRNA的模型
研究团队以果蝇细胞中报道最多的两种esiRNA前体（pre-esiRNA）——esi-1和esi-2为基础开展研究。在ATP和镁离子存在的条件下，首次获得了Dcr-2/Loqs-PD复合物与pre-esiRNA相互作用的剪切前状态（pre-dicing state）的高分辨结构，并解析了分辨率更高的剪切活性状态（dicing state）的Dcr-2/Loqs-PD/pre-esiRNA复合物结构。这些结构有助于更清晰地观测Dcr-2与底物RNA之间的相互作用关系。在剪切前状态向剪切状态转变的过程中，Dcr-2的Helicase和DUF283结构域发生了明显的构象扭转。虽然在剪切前状态中pre-esiRNA到达了Platform/PAZ结构域，但并未形成稳定的相互作用；而在ATP水解的驱动下，pre-esiRNA通过Helicase结构域继续向上传递，使其3’末端进一步移动1nt，最终稳定结合到PAZ结构域的3’结合口袋中。
在没有ATP的情况下，研究解析了Dcr-2/Loqs-PD/pre-esiRNA复合物（initial binding state）以及没有Loqs-PD辅助时的Dcr-2/pre-esiRNA复合物（loading state）的结构。研究发现，在没有Loqs-PD存在时，pre-esiRNA虽然可以一端结合在Platform/PAZ结构域，另一端穿过Helicase结构域，但Dcr-2中的多个结构域会发生显著的构象变化，导致pre-esiRNA远离RNase III结构域，无法进行剪切。这表明，pre-esiRNA的加工过程需要Loqs-PD的协助，才能使其结合到Dcr-2的Helicase结构域中，从而保证剪切的顺利进行。同时，体外生化实验表明，Dcr-2/Loqs-PD复合物对结构复杂的pre-esiRNA的剪切是从特征闭合端开始的，而非松散末端。该研究揭示了Dcr-2/Loqs-PD复合物对具有复杂结构的pre-esiRNA加工的分子机制。
清华大学生命学院王宏伟教授、王家副研究员以及复旦大学麻锦彪教授为论文共同通讯作者，清华大学生命学院2018级博士生曹娜、王家副研究员以及复旦大学邓婷博士为论文共同第一作者。国家蛋白质科学中心（北京）、清华大学冷冻电镜平台、清华大学高性能计算平台和水木未来（北京）科技有限公司为该研究提供了设备和技术支持。研究得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、北京结构生物学高精尖创新中心、清华-北大生命科学联合中心等的支持。
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