药学院秦为课题组开发活体兼容邻近标记技术TyroID解析细胞外蛋白质组的时空动态
清华新闻网3月20日电 细胞外蛋白（包括分泌蛋白与跨膜蛋白）在多细胞生物的生理调控中具有重要作用，其通过介导细胞间通讯协调复杂生理过程。病理状态下，细胞外蛋白的异常表达或修饰与癌症、神经退行性疾病及心血管疾病等发生发展密切相关。值得注意的是，超过60%的FDA批准药物靶向细胞外蛋白，因此系统解析细胞外蛋白质组对阐明生物过程分子机制、揭示疾病病理基础及开发靶向治疗策略具有重要意义。
近年来，尽管邻近标记酶（proximity labeling enzymes）和小分子光催化剂技术的发展促进了细胞外蛋白质组的解析，但这些方法的体内应用仍存在局限性。辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）的标记依赖具有细胞毒性的过氧化氢（图1a），限制了其在活体动物中的直接使用；而生物素连接酶（如BioID和TurboID）虽然可以实现活体细胞内蛋白的标记，却因细胞外微环境中ATP浓度不足导致胞外标记效率受限。此外，内源性生物素或过氧化氢均可能出现较高的背景干扰。可见光在活体组织中的穿透深度有限，光催化剂在体内的应用也面临挑战。
近日，清华大学药学院秦为课题组研究开发了一种无毒的邻近标记技术TyroID，实现了活体内细胞外蛋白质组的高时空分辨率解析，该技术成功应用于活体肿瘤异种移植模型HER2邻近蛋白动态解析、血浆蛋白代谢追踪及小鼠海马区特异性蛋白质组标记，解决了传统邻近标记技术解析细胞外蛋白质组的活体兼容性问题。
该研究发展了一种新型活体邻近标记技术TyroID（图1b），用于实现细胞外蛋白质组的时空动态解析。TyroID 技术的核心是基于植物或细菌来源的酪氨酸酶（tyrosinase），其可以将生物正交的苯酚底物氧化为高反应活性的邻醌（o-quinone），特异性标记邻近蛋白中半胱氨酸、赖氨酸及组氨酸等亲核氨基酸。与传统邻近标记技术相比，TyroID无需依赖过氧化氢或可见光等外源激活条件，仅需添加酚类底物即可完成原位标记。
图1.（a）过氧化物酶（如 APEX 和 HRP）标记示意图；（b）TyroID标记示意图
针对常规探针AP易渗入胞内的缺陷，团队开发了膜非通透型探针“AxxP”——通过引入四聚乙二醇连接臂阻断跨膜扩散。实验证明，75nM abmTYR联合50μM AxxP能在30分钟内实现乳腺癌细胞表面蛋白的特异性标记，与膜标志物GLUT1呈高度共定位，且维持生理状态下的蛋白空间分布。基于二甲基化定量蛋白质组学，TyroID系统成功鉴定315个高置信度细胞外蛋白。通过super-TOPP-ABPP技术解析的修饰位点均位于蛋白胞外域，证明该方法具备解析跨膜蛋白拓扑结构的独特能力。该研究进一步将TyroID应用于HER2受体邻近蛋白组解析，通过抗体靶向策略识别出LGALS1、FUS等HER2互作蛋白，并经Co-IP实验验证其结合强度与经典互作蛋白TFRC相当。
最后，基于TyroID无毒、快速标记的优势，团队探索了其在活体中的应用，这是基于过氧化物酶和可见光激活的邻近标记方法难以实现的。为此，研究人员设计了三项独立的活体实验，以验证TyroID在活体小鼠中应用的有效性：第一，活体肿瘤中HER2邻近蛋白的分析，鉴定出内质网ATP酶（VCP）、钙调理蛋白2（CNN2）及分选连接蛋白9（SNX9）等在细胞培养实验中未发现的HER2邻近蛋白；第二，定量分析44种血浆蛋白的turnover速率，揭示Apoc3、Apoa4和Apoe等载脂蛋白的高代谢特性；第三，海马区原位标记丛蛋白A1（Plxna1）、神经软骨蛋白（Ncdn）及神经元膜糖蛋白M6-a（Gpm6a）等脑特异性蛋白。
图2.TyroID在活体内的应用
综上，TyroID通过酶促生成邻醌实现无毒、快速的细胞外标记，突破了传统技术对过氧化氢或可见光的依赖，为活体蛋白质组动态解析提供了创新工具。其在肿瘤微环境研究、血浆蛋白周转监测及神经生物学领域的应用，展现了广阔的研究潜力。
相关研究成果以“活体兼容邻近标记技术TyroID解析细胞外蛋白质组的时空动态”（Spatiotemporally resolved mapping of extracellular proteomes via in vivo-compatible TyroID）为题，于3月15日发表于《自然·通讯》（Nature Communications）。
清华-北大生命科学联合中心、清华大学药学院助理教授秦为为论文的通讯作者，清华大学药学院博士生张梓涓和博士后王妍坤为论文的第一作者。中国科学院遗传与发育生物学研究所武照伐研究员为本文提供了重要实验帮助。
研究得到国家重点研发计划青年科学家项目，国家自然科学基金重大研究计划培育项目、面上项目，中国博士后面上项目，清华-北大生命科学联合中心，清华大学笃实计划，北京生物结构前沿研究中心，北京分子科学国家实验室基础研究基金，深圳市医学研究基金等的支持。
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